作為北京大學新歷史階段的改革者和創造者，蔡元培心目中的北京大學就應該是純粹研究學問的機構。“學術至上、學術自由”的觀點也明確規定出了北京大學的宗旨。但就在蔡元培出任北京大學期間，爆發了舉世震驚的五四運動，北京大學的學生也成為了這場運動中的重要力量。
1919年，第一次世界大戰的戰勝國在巴黎近郊的凡爾賽宮召開了戰后和平會議。會上，中國代表最初提出的取消列強某些特權的七項希望條件及廢除二十一條不平等條約的要求均被無理否決，最后和會竟將原德國在山東攫取的一切權益轉由日本接管。在這危急的時刻，蔡元培迅即召集北京大學學生代表，告知這一消息，同時以北京歐美同學會名義急電中國首席代表章宗祥，勸誡其切勿在合約上簽字。而北大學生聞風而動，當晚就在北河沿第三禮堂召開大會，把原來訂在5月7日的“國恥日”舉行的活動提前到5月4日。當天下午，北大等校的3000多名學生走上街頭游行示威，要求“外爭主權，內懲國賊”，隨即火燒曹汝霖的住宅，痛毆章宗祥，而32名學生已遭警方拘捕。5月5日，蔡元培率領校長代表團和北洋政府進行了交涉，以人格做擔保，要求釋放被捕學生。
在蔡元培和各大學校長的努力下，被捕學生最終獲得了釋放，而五四運動也取得了成功。
對于這一事件，蔡元培的心情頗為復雜，他個人認為全國學風應該從熱衷政治轉為潛心學業，不鼓勵學生，涉及政事。但此次中國外交失敗，令他痛心疾首，環顧國人，只有青年學生敢于表達民意，在這冷漠麻木的社會里顯得難能可貴。因此得知學生將采取行動，他沒有全力阻止，而是保持某種放任的姿態。
“五四”之后的北京大學呈現出自由活躍的局面，構成一派自由、開放辦學的宏大氣象。應當說，這氣象來自蔡元培的教育理念，也是來自“五四”之后那活躍舒展的社會文化氛圍，對現代的大學也有著深遠的影響。
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